葡聚糖包裹的纳米氟磷灰石示踪骨髓间充质干细胞

【摘要】研究目的：骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)作为临床骨组织工程最常用的种子细胞,已被广泛研究,其标记及示踪问题也颇受大家关注,常用的有机染料如CM-DIL和EGFP等存在荧光寿命短,体内不稳定及潜在的细胞致癌性等不足。水热法合成的掺杂镧系元素氟磷灰石(FHA:Tb3+/Eu3+,Tb/Eu-FHA)纳米粒子的粒度均匀,稳定性好,荧光寿命长,细胞亲和力高,和BMSCs共培养后可被BMSCs吞噬,在特定波长光的激发下可发出绿色／红色荧光。本实验采用水热法合成Tb/Eu-FHA,以葡聚糖进行表面修饰后和比格犬BMSCs共培养,观察Tb/Eu-FHA标记BMSCs效果,检测该纳米粒子对BMSCs增殖及分化影响,并将被标记的BMSCs植入动物体内,观察Tb/Eu-FHA在体内的稳定性,为BMSCs的体外及体内研究提供了一种新的标记手段,为进一步研究再生医学与骨组织工程中BMSCs在体内的迁移及转归提供新的思路。研究方法：1.以硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、硝酸铽(Tb(NO3)3·6H2O)、磷酸钠(Na3PO4·12H2O)、氟化钠(NaF)、十八胺(Octadecylamine)、油酸(Oleicacid)、乙醇(Ethanol)以及环已烷(Cyclohexane)为原料,采用水热法合成掺杂镧系元素(铕Eu或铽Tb)的纳米氟磷灰石,离心收集FHA纳米颗粒,加入环已烷与葡聚糖(Dextran)混合溶液中,并加入四氢呋喃(Tetrahyfrofuran),超声波处理后离心收集,得到经葡聚糖表面修饰的掺杂镧系元素纳米氟磷灰石。2.掺杂镧系元素纳米氟磷灰石的参数检测：X-射线衍射仪检测掺杂镧系元素纳米氟磷灰石的结晶程度及物象组成,红外吸收光谱分析样品中所含的阴离子基团,透射电镜下观察纳米粒子基本形态、颗粒粒径、粒径分布及团聚等情况。倒置荧光显微镜下观察掺杂不同浓度镧系元素的纳米氟磷灰石的荧光特性,荧光分光光度计检测荧光强度。3.全骨髓培养法从犬骨髓血中分离纯化犬BMSCs(caninebonemarrowmesenchymalstemcells,cBMSCs),体外向成骨、成软骨、成脂三系诱导分化,流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44和CD45等细胞表面标志物表达。贴壁纯化培养后的cBMSCsCD29和CD44表达为强阳性,而CD34和CD45的表达为阴性。将cBMSCs和不同浓度的葡聚糖表面修饰后的Tb/Eu-FHA纳米颗粒共培养后,检测cBMSCs增殖及分化情况。4.倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察共培养后的cBMSCs荧光强度,real-timePCR检测成骨相关因子碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP),I型胶原(alpha1chainoftypeIcollagen,COL1α1)以及骨连蛋白(osteonectin,ON)等mRNA的表达变化,ELISA法检测ALP蛋白表达变化。5.将共培养后的cBMSCs按1×107/ml接种于PCL支架上,孵箱内放置3天,接种后的支架移植入裸鼠体内背部皮下,术后一个月及三个月取材,裸鼠处死,制作快速冰冻切片、HE染色切片,倒置荧光显微镜下观察。研究结果：1.水热法合成的纳米荧光氟磷灰结构规则,呈长粒状结构,直径约20nm,平均长度约110-170,微溶于水。2.Tb-FHA在激发光激发下呈绿色荧光,发射波长为543nm,而Eu-FHA则呈红色荧光,发射波长为617nm,XRD检测呈典型的FHA六角晶体结构。3.共培养后的cBMSCs在倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下可分别呈现绿色(Tb-FHA)或红色(Eu-FHA)荧光。MTS法检测共培养后细胞增殖情况,50ug/ml、100ug/ml和200ug/ml组各组中细胞增殖未受明显影响。4.Real-timePCR检测cBMSCs与Tb-FHA共培养后14天、21天各组成骨相关因子ALP、COL1α1和ON表达均明显升高,Tb-FHA对成骨诱导液在成骨诱导方向有协同作用,ELSIA法检测ALP蛋白表达结果与PCR一致。5.植入裸鼠体内后1月、3月快速冰冻切片及HE染色结果,可见绿色荧光,证明了Tb-FHA在体内可长期存在并发出荧光。结论：1.水热法合成的Tb/Eu-FHA颗粒均一,具有典型氟磷灰石晶体结构,在掺杂Tb或Eu后分别发出绿色或红色荧光,荧光强度高,在葡聚糖包裹修饰后由疏水性变为亲水性,细胞亲和力提高,适合用来进行生物学试验。2.全骨髓培养法可以高效的从比格犬骨髓中分离培养出BMSCs,具有向成骨、成软骨和成脂方向分化的潜能,免疫表型符合骨髓间充质干细胞的特征。3.葡聚糖修饰的Tb/Eu-FHA生物相容性好,细胞亲和力高,可以用来标记BMSCs。4.标记后的BMSCs向成骨方向分化,且Tb-FHA和传统的成骨诱导液对BMSCs成骨分化具有协同作用,100ug/ml的浓度为最佳浓度。5.葡聚糖修饰的Tb-FHA可以用来进行体内示踪,Tb-FHA在体内可长期稳定存在。6.葡聚糖修饰的Tb/Eu-FHA作为BMSCs的标记及示踪剂,价格低廉、制造简单、便于保存、使用方便且性能稳定,在骨组织工程领域中具有良好的应用前景。
【作者】曾海峰；
【导师】滕利；
【作者基本信息】北京协和医学院，整形外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；镧系元素；细胞示踪；氟磷灰石；

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